Получение рекомбинантного белка B-субъединицы Н,К-АТФазы с флуорисцентным белком YFР

Получение рекомбинантного белка β-субъединицы Н,К-АТФазы с флуорисцентным белком YFР

Турдикулова Шахло Уткуровна,

кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиологии и биотехнологии» Национального Университета Узбекистана.

Желудочная Н,К-АТФаза – фермент, ответственный за секрецию кислоты париетальными клетками эпителия желудка, принцип работы насоса заключается в осуществлении обмена протона на ион калия. Н,К-АТФаза состоит из двух субъединиц – каталитической α-субъединицы и вспомогательной β-субъединицы, имеющей семь сайтов гликозилирования [Geering, 2001; Vagin et al., 2007]. Н,К-АТФаза в покое располагается в тубуловезикулярных элементах париетальных клеток и передислоцируется в секреторные каналикулы апикальной мембраны в ответ на стимуляцию кислотообразования. Такое рециркулирование помпы между внутриклеточными тубуловезикулами и апикальной мембраной несомненно является ключевым моментом в регуляции кислотообразования [Sachs et al., 2000; Smolka et al., 1983].

Необходимость использования YFP-меченых белков в данном исследовании, объясняется использованием конфокальной микроскопией для выявления местоположения белка в клеточной культуре. Применение методов иммуногистохимии требует фиксирования исследуемого материала, в то время как за YFP мечеными белками можно наблюдать непосредственно в живых клетках. Еще одним преимуществом можно назвать удобство получения клонов клеток стабильно экспрессирующих рекомбинантный белок. Для этих целей нами была получена рекомбинантная векторная молекула, содержащая ген β субъединицы Н.К-АТФазы с присоединенным флуоресцентным маркером. В качестве исходной векторной конструкции использовалась плазмида pEYFP-C1 (BD Bioscience Clontech). Это челночный вектор, используемый для клонирования в клетках E.coli и клетках млекопитающих. Векторная молекула содержит ген, кодирующий флуоресцентный белок Yellow Fluorescent Protein (YFP), встраивание рекомбинантного гена сразу после YFP части позволяет получать fusion белок, содержащий YFP маркер на C-конце белковой молекулы пригодный для исследований in vivo.

В качестве источника гена β субъединицы Н.К-АТФазы использовали вектор рсDNA3(+)β [Lambrecht et al., 2000], кодирующий аминокислотную последовательность β-субъединицы Н,К-АТФазы кролика [Reuben et al., 1990] - (Genbank accession number M35544). Ген был клонирован в экспрессирующий вектор pEYFP-C1 путем рестрикции и лигирования в множественный сайт рестрикции вектора, находящийся между YFP частью и стоп кодоном по сайтам рестрикции BglII и BamHI. Таким образом получили вектор pEYFP-β, который кодировал гибридный белок флуоресцентного белка YFP, присоединенного к N-концу белка β-субъединицы. Полученная конструкция была трансформирована и клонирована в клетках E.coli на селективной среде, содержащей канамицин. Из полученных клонов выделяли плазмидную ДНК и проверяли путем контрольной рестрикции рестриктазами BglII и BamHI на наличие вставки. Векторные молекулы, содержащие вставку, были секвенированы на наличие вставки, ее местоположения, правильной ориентации и отсутствия возможных сдвигов рамок считывания. Нуклеотидная последовательность β-субъединицы сравнивалась с опубликованной в базе данных NCBI последовательностью гена β-субъединицы Н,К-АТФазы кролика при помощи программы Vector NTI. Только векторные молекулы, содержащие полноразмерный ген β-субъединицы Н,К-АТФазы без сдвигов рамки считывая и нуклеотидных замен или повторов использовались для последующей трансформации в клетки линии LLC-PK1.

Вектор был трансфецирован в клетки линии LLCPK-1, затем, путем поддержания концентрации 1,0 мг/мл селективного маркера G418 в течение 50-60 дней были отобраны и получены линии клеток стабильно экспрессирующие белок YFP-β, то есть в которых ген YFP-β оказался в клеточном геноме, клоны отбирались по устойчивости к селективной среде и флуоресцентному свечению. При получении линии клеток стабильно экспрессирующей белок процесс отбора клонов представляет довольно сложную процедуру, выживаемость клеток в присутствии селективного давления не всегда соответствует экспрессии нужного белка, поэтому каждый клон при достижении определенного количества клеток необходимо проверять при помощи иммуноблоттинга на наличие белка, это вызывает определенные неудобства в связи с необходимостью отбора всех имеющихся клонов на первичной селективной среде и ожидания роста клеток, прямо пропорционального количеству исходных клеток, так как каждый клон является потомством одной клетки, то вначале они растут довольно медленно. Использование YFP-меченного белка упрощает эту процедуру, позволяя отбирать только клоны с наличием флуоресцентного свечения. Таким образом, в результате селекции было отобрано 16 клонов. Каждый клон был исследован на наличие, правильный вес и достаточное количество белка путем иммуноблот анализа, а также при помощи конфокальной микроскопии проанализировано местоположение полученного белка в клетках. По этим характеристикам было отобрано два клона с оптимальной экспрессией правильно сформированного белка для дальнейших экспериментов. На рисунке 1 представлены данные иммуноблотинга и конфокальной микроскопии белка YFP-β в клетках LLC-PK1. Как видно из данных иммуноблотинга при помощи антител против β-субъединицы в клеточном лизате белок проявлялся в виде двух пятен одного весом 80-100 кДа и другого ~75 кДа, что согласно теории гликозилирования соответствует зрелой комплексно гликозилированной форме белка – верхнее пятно и высокоманнозной форме белка, находящейся на стадии созревания. Конфокальная микроскопия показала присутствие белка на апикальной мембране клеток LLC-PK1.

Кроме того, рекомбинантный белок β-субъединицу Н,К-АТФазы проверяли на наличие гликозилирования путем обработки ферментами гликозидазами и проверки веса белка путем гель электрофореза на SDS PAGE и последущим иммуноблот анализом.

Характеристика гликозилированных форм YFP-β экспрессируемых в клеточной линии LLC-PK1.

A B

Рис.1.

А. Иммуноблот анализ YFP-β белка экспрессированного в клетках LLC-PK1 и эффект обработки

различными гликозидазами. К – комплексно гликозилированная форма; Г – гибридная форма; Д – дегликозилированная форма.

В. Конфокальная микроскопия клеток LLC-PK1, экспрессирующих YFP-β.

Химерный белок YFP-β-субъединица Н,К-АТФазы обнаруживался в клеточном лизате LLC-PK1 в виде двух пятен, одного в районе 80-100 кДа и другого соответствовавшего ~75 кДа (Рис.1, линия 1). Для анализа степени и форм гликозилирования экспрессируемого белка проводили обработку белков несколькими ферментами. После обработки клеточного лизата ферментом PNGase F – полностью удаляющим гликаны, ни одна из полос 80-100 кДа и 75 кДа не проявлялась, в то время как появлялось одно пятно в районе ~55 кДа соответствующее по весу дегликозилированной форме YFP-β (линия 3). Тот же самый продукт образовался при обработке клеточного лизата ферментом эндогликозидазой Н (EndoH), однако при этом исчезала только нижняя полоса, а верхняя полоса, по-прежнему, проявлялась на Вестерн Блоте (полоса 2). Известно, что EndoH способна воздействовать только на высокоманнозную или гибридную формы гликопротеина, в то время, как комплексная форма имеет устойчивость к воздействию этого фермента. Таким образом, полоса соответствующая 80-100 кДа представляет собой комплексно гликозилированную фракцию YFP-β. EndoH чувствительная, соответствующая 75 кДа фракция является высокоманозной формой YFP-β.

В результате проведенных экспериментов получена рекомбинантная ДНК гибридного белка YFP-β субъединицы Н,К-АТФазы, которая была экспрессирована в клеточной линии LLC-PK-1. Белок имеет правильную конформационную структуру, соответствующий молекулярный вес и проходит все стадии гликозилирования.

Литература

1. Geering, K. The functional role of beta subunits in oligomeric P-type ATPases.// J Bioenerg Biomembr. -2001.-Vol 33;-№ 5.- P.425-438.

2. Lambrecht, N., K. Munson, O. Vagin, et al. Comparison of covalent with reversible inhibitor binding sites of the gastric H,K-ATPase by site-directed mutagenesis.// J Biol Chem. -2000.-Vol 275;-№ 6.- P.4041-4048.

3. Reuben, M. A., L. S. Lasater and G. Sachs. Characterization of a beta subunit of the gastric H+/K(+)-transporting ATPase.// Proc Natl Acad Sci U S A. -1990.-Vol 87;-№ 17.- P.6767-6771.

4. Sachs, G., J. M. Shin, K. Munson, et al. Review article: the control of gastric acid and Helicobacter pylori eradication.// Aliment Pharmacol Ther. -2000.-Vol 14;-№ 11.- P.1383-1401.

5. Smolka, A., H. F. Helander and G. Sachs. Monoclonal antibodies against gastric H+ + K+ ATPase.// Am J Physiol. -1983.-Vol 245;-№ 4.- P.G589-596.

6. Vagin, O., S. Turdikulova and E. Tokhtaeva. Polarized membrane distribution of potassium-dependent ion pumps in epithelial cells: different roles of the N-glycans of their beta subunits.// Cell Biochem Biophys. -2007.-Vol 47;-№ 3.- P.376-391.

Поступила в редакцию 30.06.2008 г.