Опухоли костей и мягких тканей группы PNET/саркомы Юинга, основные критерии морфологической и дифференциальной диагностики

НА ГЛАВНУЮ

Буланов Дмитрий Владимирович,

соискатель, врач-патологоанатом Московской городской онкологической больницы №62.

Опухоли костей и мягких тканей являются одним из труднейших разделов патологии как с точки зрения своевременной и правильной диагностики, так и в свете поиска эффективных методов рационального лечения [1, 3, 5]. Несмотря на значительный прогресс знаний в области костной патологии до настоящего времени остается много неясного в вопросах диагностики мелкокруглоклеточных опухолей костей и мягких тканей [10, 11]. Прогресс в молекулярной биологии опухолей человека, иммуногистохимии и цитогенетике позволил по-новому оценить и осмыслить отдельные виды опухолей, которые прежде считались или просто недифференцированными, или были отнесены к иным гистогенетическим источникам [2, 4, 6]. С помощью новых молекулярно-генетических методов исследования для многих мелкокруглоклеточных опухолей костей удалось установить нейроэктодермальное происхождение. В эту категорию были включены многие костные и экстраскелетные опухоли Юинга/PNET [12, 13, 15]. В исследованиях последних лет всё чаще предпринимаются попытки установить связь между так называемыми «мелкокруглоклеточными опухолями скелета» и их аналогами, возникающими в мягких тканях. В последние годы на основании данных классической морфологии и результатов, полученных с помощью новых методов исследования (культура клеток, молекулярная генетика, иммуногистохимия), выделена группа низкодифференцированных мелкокруглоклеточных опухолей нейроэктодермальной природы, развивающихся в мягких тканях и костях у детей и взрослых лиц молодого возраста, для обозначения которых предложен термин «примитивные периферические нейроэктодермальные опухоли» (PNET) [8, 9, 16]. Проблема имеет весьма существенное практическое значение для проведения дифференциальной диагностики в ряду формально похожих злокачественных опухолей (лимфома, эмбриональная рабдомиосаркома, синовиальная саркома, мелкоклеточный вариант остеосаркомы), в связи с чем, примитивная нейроэктодермальная опухоль, саркома Юинга, вызывают в гистогенетическом и клинико-диагностическом отношении особый научно-практический интерес [7, 17, 18].

Цель и задачи работы

На основе анализа литературных данных, примерах собственных клинических наблюдений представить морфологическую, иммуногистохимическую характеристику, критерии дифференциальной диагностики примитивных нейроэктодермальных опухолей.

Материалы и методы

Материал был получен от 26 пациентов с мелкокруглоклеточными опухолями костей и мягких тканей, 19 мужчин и 7 женщин в возрасте от 16 до 70 лет; преобладали пациенты молодого возраста от 16 до 28 лет (средний возраст составил 26.8). Локализация опухолей представлена в следующих анатомических областях: длинные трубчатые кости – 9, кости таза – 7, крестец – 2, лопатка – 1, забрюшинное пространство – 2, мягкие ткани различной локализации – 4, средостение – 1. Морфологическое исследование фиксированного забуференным формалином операционного материала и фрагментов ткани опухоли полученной при тонкоигольной биопсии включало в себя микроскопическое исследование серийных срезов окрашенных рутинными методами (гематоксилин-эозин) с применением в случаях костных опухолей обычной декальцинации. Иммуногистохимическое исследование с помощью иммунопероксидазного метода проводилось на срезах с парафиновых блоков толщиной 3—4 мкм. После депарафинизации и обезвоживания в целях блокирования эндогенной пероксидазы срезы обрабатывали 0,3% Н₂О₂ в течение 20 мин, промывали в дистиллированной воде и с целью демаскировки антигенных детерминант подвергали температурной обработке в буферах рН = 6,0 (Target Retrievel solution, DAKO) в СВЧ-печи длительностью 20 мин или на «водяной бане» в течение 30 мин при t = 98 °С. Для ряда антител использовался EDTA-буфер с рН = 9,0, температурную обработку в этом случае проводили в течение 30—35 мин. После отмывания в TBS 3 раза по 5 мин наносились первичные мышиные или кроличьи антитела. Инкубацию с первичными антителами проводили во влажной камере в течение 30-60 мин (в зависимости от маркеров — цитоплазматических, мембранных или ядерных) при комнатной температуре. После инкубации с первичными антителами срезы промывали в TBS 3 раза по 5 мин, затем на 30 мин при комнатной температуре наносился авидин-биотиновый комплекс, конъюгированный с пероксидазой, с использованием LSAB+, Dako (двухшаговый метод) или системы детекции EnVision+ (Dako) (одношаговый метод) в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление пероксидазной активности осуществляли с помощью DAB+ (Dako). Ядра докрашивали гематоксилином. При использовании системы детекции EnVision+ методика сокращалась на один «шаг», так как после первичных антител наносился полимер, конъюгированный с вторичными антителами к иммуноглобулинам мыши и кролика, и ферментом.

Использовали первичные антитела к CD99 (“Dako”), CD45 (“Dako”), CD20 (“Dako”), EMA (“Dako”), pan-CK (“Dako”), Vimentin (“Dako”), Desmin (“Dako”), Myogenin (“Dako”), Ki-67 (“Dako”), p53 (“Dako”). В качестве вторичных антител использовали биотинилированные антитела к иммуноглобулинам мыши и кролика (EnVision, “Dako”).

В 14 случаях проведено молекулярно-генетическое, и цитогенетическое исследование материла с использованием FISH и PCR-реакции (Institut Ortopedii Rizzoli, Bologna, Italy, Department of Pathology, Prof A. Llombart-Bosh), морфометрический анализ иммуногистохимических маркеров клеточной пролиферации.

Результаты работы

Проведено клинико-морфологическое сопоставление с учётом данных морфологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического анализа материалов. Первоначальный диагноз саркомы Юинга/PNET в группе пациентов (14 наблюдений), в которой было проведен молекулярно-генетический анализ образцов ткани опухоли был изменен: в 8 случаях был диагностирован классический вариант саркомы Юинга, 1 - крупноклеточный вариант саркомы Юинга, 1 – атипичный вариант саркомы Юинга, 1 – саркома Юинга с эндотелиальным типом дифференцировки, в 2 случаях подтвержден диагноз PNET, в 1 случае – диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. Иммуногистохимически во всех случаях саркомы Юинга/PNET обнаружена положительная реакция от умеренной до резко выраженной с CD99. В большинстве случаев положительная реакция с CD99 характеризовалась ярким мембранным окрашиванием опухолевых клеток. Маркеров мышечной дифференцировки во всех случаях саркомы Юинга/PNET не выявлено. Реакция с десмином и миогенином была отрицательна. Эпителиальный мембранный антиген (EMA) и цитокератины (CK) экспрессировались лишь в 15% случаев, реакция характеризовалась слабым мембранным и dot-like окрашиванием клеток. Ядерная экспрессия мутантного белка гена p-53 была обнаружена в 70% случаев, индекс пролиферативной активности опухолевых клеток с маркером Ki-67 варьировал от 2 до 45,8% (положительное ядерное окрашивание опухолевых клеток). В случае с диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой установлен характерный иммунофенотип опухолевых клеток CD45+, CD20+. В результате молекулярно-генетического и цитогенетического исследования во всех случаях саркомы Юинга/PNET обнаружена транслокация EWN локуса 22q12, гомозиготная делеция гена p16 была обнаружена в 1 случае эндотелиального типа саркомы Юинга.

Выводы

Диагностика мелкокруглоклеточных опухолей костей и мягких тканей в ряде случаев представляет определенные трудности и требует тщательного методологического подхода в постановке морфологического диагноза. Проведенное исследование позволило охарактеризовать гетерогенную группу мелкокруглоклеточных опухолей, определить “маркерные” дифференциальные признаки. Использование широкой дифференциально-диагностической панели антител позволяет своевременно поставить правильный диагноз, выделить варианты обширного семейства мелкокруглоклеточных опухолей, что позволяет накапливать материал для проведения дальнейших клинико-морфологических сопоставлений.

Литература

1. Веснин А.Г., Семенов И.И. Атлас лучевой диагностики опухолей опорно-двигательного аппарата: Часть 1: Опухоли скелета. – СПб.: Невский диалект, 2003.

2. Галахін К., Лломбарт-Бош А., Мельник М. и др. Диференційна імуногістохімічна діагностика злоякісних пухлин сімейства Юїнга // Онкология. - 2001. - Т. 3, № 2 -3. - С.146-150.

3. Гальперин Э.Е., Констайн Л.Д., Тарабел Н.Д Лучевая терапия в детской онкологии. - М., 1999. - 539 c.

4. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы // Практическая онкология. - 2002. - № 1.- С 38-44.

5. Головин Д.И. Ошибки и трудности гистологической диагностики опухолей: Руководство для врачей. – Л.: Медицина, 1982. – 304 с.

6. Дурнов Л.А., Голдлбенко Г.В., Курмашов В.И. Детская онкология. - М.,1997. – 305 с.

7. Кешта Расми Ахмад Молекулярно-биологические маркеры как факторы прогноза при саркоме мягких тканей: Автореф. дисс. … канд. мед. наук. - М.,2002. - 29 с.

8. Киселев Л.П. Молекулярная диагностика и интенсификация химиотерапии прогностически неблагоприятных форм саркомы Юинга у детей: Автореф. дисс. … канд. мед. наук. - Минск, 2007. - 21 с.

9. Bacci G., Balladelli A., Forni C. et al. Ewing's sarcoma family tumours: Differences in clinicopathological characteristics at presentation between localised and metastatic tumours // J. Bone Joint. Surg. Br. – 2007. – Vol.89, № 9. – P.1229-1233.

10. Barnoud R., Delattre O., Peoc’h M. et al. Desmoplastic small round cell tumor: RT-PCR analysis and immunohistochemical detection of the Wilm’s tumor gene WT1 // Pathol. Res. Pract. – 1998. – Vol. 194. – P.693-700.

11. Bridge R.S., Rajaram V., Dehner L.P. et al. Molecular diagnosis of Ewing sarcoma .primitive neuroectodermal tumor in routinely processed tissue: a comparison of two FISH strategies and RT-PCR in malignant round cell tumors // Mol. Pathol. – 2006. – Vol.19. – P.1-8.

12. Brooks J.S. Immunohistochemistry in the differential diagnosis of soft tissue tumors // Monogr. Pathol. – 1996. – Vol.38. – P.65-128.

13. Brown A.P., Fixsen J.A., Plowman P.N. et al. Local control of Ewing`s sarcoms: analysis of 67 patients // Br. J. Radiol. – 1987. – Vol.60. – P.261-268.

14. Cavazzana A.O., Magnani J.L., Ross R.A. et al. Ewing’s sarcoma is an undifferentiated neuroectodermal tumor // Prog. Clin. Biol. Res. – 1988. – Vol.271. – P.487-498.

15. Chan J.K. Advances in immunohistochemistry: impact on surgical pathology practice // Semin. Diagn. Pathol. - 2000. – Vol. 17. – P.170-177.

16. Соffin Сh.M., Dehner L.P., O'Shea P.A. Pediatric soft tissue tumors. А clinical, pathological and therapeutic approaches. - Baltimore: Williams а Williams, 1997. - 412 р.

17. Cotterill S.J., Ahrens S., Paulusse M. et al. Prognostic factors in Ewing tumor of bone: analysis of 975 patients from the European intergroup cooperative Ewing sarcoma study group // J. Clin. Oncol. – 2000. – Vol.18.- P.3108-3114.

18. Craft A., Cotterill S., Malcolm A. et al. Ifosfamide-containing chemotherapy in Ewing sarcoma: the second United Kingdom children’s cancer study group and the medical research council Ewing tumor study // J. Clin. Oncol. - 1998. – Vol.16. – P.3628–3633.

Поступила в редакцию 19.01.2009 г.