Оценка различий в электрических свойствах мембран эритроцитов разных групп крови системы АВО
Estimation of distinctions in electric properties red blood cell membrane at different blood types
Голубков Вадим Валерьевич,
аспирант кафедры патологической физиологии Иркутского государственного медицинского университета.
Научный руководитель – доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой патологической физиологии
Семинский Игорь Жанович.
Рассматривается роль сиаловой кислоты в формировании отрицательного заряда мембраны эритроцита. Отмечается влияние антигенов групп крови АВО на расположение молекул сиаловой кислоты на мембране эритроцита. Описывается опыт по определению различий в электрическом заряде мембран эритроцитов разных групп крови с помощью лантан-индуцированной агрегации интактных эритроцитов. Анализируются полученные различия и выносится предположение о их роли в протекании тромбоишемических состояний.
Ключевые слова: сиаловые кислоты, группы крови АВО, заряд мембраны, агрегация.
The role of sialic acid in formation a negative electrical charge of red blood cell membrane. Influence of АВО blood types antigens on localization of sialic acid molecules on membrane surface. Experimental finding differences of electrical charge red blood cells by lantan-induced aggregation are described. The received distinctions are analyzed and the assumption of their role in course ischemic conditions.
Key words: sialic acid, АВО blood groups, aggregation, membrane charge.
Как известно, эритроциты млекопитающих несут на внешней поверхности своей мембраны отрицательный электрический заряд, создаваемый карбоксильными группами сиаловой (нейраминовой) кислоты. В ранних исследованиях была доказана существенная роль отрицательного заряда мембраны для предотвращения спонтанной агрегации клеток. По данным разных авторов, значение этого заряда принималось равным от 4 до 15 миллионов элементарных зарядов, а минимальное значение заряда эритроцита, необходимое для обеспечения его несоприкасаемости с другими эритроцитами в кровотоке, полученное расчетным путем, равнялось 22тыс. элементарных зарядов [6, 12].
Удаление сиаловых кислот с поверхности мембраны приводило к самопроизвольной или легко индуцируемой крупномолекулярными белками агрегации, причем эти изменения не зависели от выбранного буферного раствора [16, 18, 20, 26].
Установлено, что сиаловые кислоты располагаются на мембране эритроцита неодинаково по плотности, в зависимости от группы крови человека.
Распределение различных групповых антигенов на поверхности мембраны эритроцита неодинаково, по отношению к молекулам сиаловой кислоты, которая, в свою очередь, может распределяться диффузно, или скоплениями с находящимся в центре или на периферии скопления типоспецифичным антигеном. Предполагается, что подобное взаиморасположение может определять стабильность сиаловой кислоты, что имеет значение в ряде патологических процессов [15].
В то же время, было установлено, что наличие на мембране эритроцита любых иных молекул, помимо сиаловых кислот, может изменять величину электрического заряда мембраны [3, 25].
Известно, что типоспецифичность эритроцитов по системе групп крови АВО обеспечивают мукополисахаридные фрагменты, различные для разных групп крови. Так, первая группа крови характеризуется лишь базовым антигеном H, вторая группа определяется дополнительным антигеном: N-ацетил-D-галактозамин, третья – D-галактозой, а для четвертой свойственно примерно равное распределение на мембране антигенов второй и третьей групп [1, 4].
Целью настоящего исследования была попытка обнаружить различие в электрическом заряде мембран эритроцитов, относящихся к разным группам крови.
Материалы и методы
Прямое измерение заряда мембраны эритроцита представляется сложной задачей ввиду малых размеров клетки, сложностью ее геометрической формы и чувствительностью к условиям проведения опыта.
В качестве одного из методов изучения электрических свойств эритроцитов ранее предлагалось измерение их подвижности в постоянном электрическом поле. Было установлено, что скорость движения клеток в растворе электролита под воздействием электрического поля зависит от многих факторов, среди которых: величина pH, ионная сила раствора, структура мембраны клетки, в том числе расположенные на ней молекулы, температура среды и пр. От размеров, формы эритроцита, скорость его движения в электрическом поле не зависит, но значимо уменьшается при старении клеток, на основании чего было выдвинуто предположение о ведущей роли снижения электрического заряда мембраны эритроцита и уменьшения ее деформируемости в процессах элиминации старых клеток из кровеносного русла [13, 14, 17, 27].
Стоит заметить, что изучение электрофоретической подвижности эритроциттов позволяет оценить лишь т.н. дзета-потенциал, представляющий собой результат взаимодействия заряженной внешней поверхности мембраны клетки и ионов электролита. Логично предположить, что дзета-потенциал не может в достаточной мере отражать реальный заряд поверхности мембраны эритроцита. Предполагая, что различия в величинах электрического заряда между эритроцитами разных групп крови могут быть невелики – в пределах 5-10%, представляется вероятным, что результаты, полученные посредством изучения электрофоретической подвижности эритроцитов, могут оказаться малодостоверными.
В настоящем исследовании был использован косвенный метод измерения электрического заряда мембраны эритроцита, посредством индуцированной агрегации интактных эритроцитов хлористым лантаном
Положительно заряженные ионы лантана, обладают способностью связываться с карбоксильными группами сиаловых кислот, расположенных на мембране, инактивируя, таким образом, их отрицательный заряд. Потеря заряда эритроцитами приводит сначала к более плотному их взаиморасположению в растворе, а затем к агрегации. Подобный вариант агрегации маловероятен в условиях кровотока, где существует несколько противосвертывающих механизмов, но применим в экспериментах in vitro [9, 21, 22, 24].
Предполагается, что количество раствора хлористого лантана, необходимое для появления стойкой агрегации, будет зависеть от изначального электрического заряда поверхности эритроцита.
На метод индуцированной агрегации эритроцитов хлористым лантаном ранее был получен патент [5]. Однако, стоит отметить, что в данном исследовании методика автора патента была изменена: осаждение эритроцитов достигалось путем отстаивания, не центрифугирования, во избежание повреждения клеток и не использовался глутаровый альдегид, поскольку в ряде работ отмечалось влияние альдегидов на электрический заряд мембраны клетки [10, 19, 23].
В работе использовались образцы крови здоровых доноров. Дифференциация крови по группам системы АВО производилась с помощью стандартного набора цоликлонов, производства ООО «Медиклон»; для работы использовались группы крови О, А, В, АВ не содержащие антигены системы резус и антигена Kell. Всего в опыте участвовало 9 образцов О(I) группы крови, 8 – второй А (II), 9 – третьей B(III) и 5 – четвертой AB(IV) группы крови.
Взятая кровь консервировалась посредством 3,8% раствора цитрата натрия, а затем дважды отмывалась десятикратным объемом раствора 0,9% раствора хлорида натрия.
Кровь хранилась при температуре 4-5оС. Опыт производился при комнатной температуре, на третий день после забора крови. Применялся реактив LaCl3*7H2O, производства ООО «Нева-реактив» г. Санкт-Петербург.
Во взвесь отмытых эритроцитов, разведенных физиологическим раствором 1:20, добавлялся реактив хлористого лантана, различных концентраций: 20, 40, 60, 80, 100, 120мкМ, затем отмечалось время наступления агрегации эритроцитов.
Оценка результатов индуцированной агрегации интактных эритроцитов производилась по различию во времени, необходимом для отчетливой агрегации в повышающихся концентрациях раствора хлорида лантана, для разных групп крови. Пороговым значением концентрации хлористого лантана считалась та концентрация, при использовании которой агрегация эритроцитов наступала в течение 5 (пяти) секунд.
Результаты и обсуждение
Результаты индуцированной агрегации эритроцитов разных групп крови приведены в таблице 1
Таблица 1.
Результаты La-индуцированной агрегации эритроцитов.
|
Группа крови О(I) |
Группа крови А(II) |
||
|
№ |
Пороговая концентрация La, мкМ |
№ |
Пороговая концентрация La, мкМ |
|
1 |
60 |
1 |
80 |
|
2 |
60 |
2 |
80 |
|
3 |
60 |
3 |
80 |
|
4 |
60 |
4 |
80 |
|
5 |
60 |
5 |
80 |
|
6 |
60 |
6 |
80 |
|
7 |
80 |
7 |
80 |
|
8 |
80 |
8 |
80 |
|
9 |
100 |
|
|
|
10 |
|
|
|
|
Группа крови B(III) |
Группа крови АB(IV) |
||
|
№ |
Пороговая концентрация La, мкМ |
№ |
Пороговая концентрация La, мкМ |
|
1 |
60 |
1 |
80 |
|
2 |
80 |
2 |
100 |
|
3 |
80 |
3 |
100 |
|
4 |
80 |
4 |
100 |
|
5 |
100 |
5 |
100 |
|
6 |
100 |
|
|
|
7 |
100 |
|
|
|
8 |
120 |
|
|
|
9 |
120 |
|
|
|
|
|
|
|
Оценка достоверности полученных различий производилась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для малых выборок. Расчеты проводились с помощью программы STATISTICA.
Результаты сравнительной оценки индуцированной агрегации, попарно между группами крови, приведены далее, в ряде таблиц 2.1 – 2.6.
Таблица 2.1.
Сравнение O (I) и A (II) групп.
|
Сум.ранг O |
Сум.ранг A |
U |
Z |
p-уров. |
Z скорр. |
p-уров. |
N набл. O |
N набл. A |
2-х стор точный p |
|
61,0 |
92,0 |
16,0 |
-1,92450 |
0,054293 |
-2,21500 |
0,026761 |
9 |
8 |
0,059235 |
Таблица 2.2.
Сравнение O (I) и B (III) групп.
|
Сум.ранг O |
Сум.ранг B |
U |
Z |
p-уров. |
Z скорр. |
p-уров. |
N набл. O |
N набл. A |
2-х стор точный p |
|
58,5 |
112,5 |
13,5 |
-2,38416 |
0,017119 |
-2,49898 |
0,012456 |
9 |
9 |
0,014192 |
Таблица 2.3.
Сравнение O (I) и AB (IV) групп.
|
Сум.ранг O |
Сум.ранг AB |
U |
Z |
p-уров. |
Z скорр. |
p-уров. |
N набл. O |
N набл. A |
2-х стор точный p |
|
49,0 |
56,0 |
4,0 |
-2,46667 |
0,013638 |
-2,64404 |
0,008193 |
9 |
5 |
0,011988 |
Таблица 2.4.
Сравнение A (II) и B (III) групп.
|
Сум.ранг A |
Сум.ранг B |
U |
Z |
p-уров. |
Z скорр. |
p-уров. |
N набл. O |
N набл. A |
2-х стор точный p |
|
56,0 |
97,0 |
20,0 |
-1,53960 |
0,123659 |
-1,80909 |
0,070438 |
8 |
9 |
0,138791 |
Таблица 2.5.
Сравнение A (II) и AB (IV) групп.
|
Сум.ранг A |
Сум.ранг AB |
U |
Z |
p-уров. |
Z скорр. |
p-уров. |
N набл. O |
N набл. A |
2-х стор точный p |
|
40,0 |
51,0 |
4,0 |
-2,34216 |
0,019173 |
-2,92119 |
0,003487 |
8 |
5 |
0,018648 |
Таблица 2.6.
Сравнение B (III) и AB (IV) групп.
|
Сум.ранг В |
Сум.ранг AB |
U |
Z |
p-уров. |
Z скорр. |
p-уров. |
N набл. O |
N набл. A |
2-х стор точный p |
|
65,5 |
39,5 |
20,5 |
-0,266667 |
0,789726 |
-0,288774 |
0,772754 |
9 |
5 |
0,797203 |
Серым цветом в таблицах 2.1-2.6 выделены критерии, соответствующие уровню значимости p≤0,05.
По результатам индуцированной хлористым лантаном агрегации O (I) группа крови достоверно отличается от всех прочих. Также, достоверным являются полученные различия между A(II) и AB(IV) группами крови. B(III) группа крови не показала существенных отличий в агрегации от прочих, кроме O (I).
Исходя из полученных данных, было предположено, что электрический заряд эритроцитов, относящихся к разным группам крови, неодинаков, причем наиболее нестойкими к воздействию ионов лантана выглядят эритроциты O (I) группы, а обладающие наиболее мощным зарядом мембраны – эритроциты AB (IV) группы. Кроме того, анализируя значения концентрации хлористого лантана, приводившие к агрегации эритроцитов, можно выделить весьма своеобразную реакцию эритроцитов B (III) группы крови – разброс полученных значений, в отличие от образцов прочих групп, достаточно велик.
Возможно, что различия в электрическом заряде эритроцитов, разных групп крови, обусловлены групповыми антигенами АВО. Количество раствора хлористого лантана, необходимое для инактивирования отрицательного заряда мембран эритроцитов различается для разных групп крови, что дает основание для подобного предположения.
Принимая во внимание, что силы электроотталкивания, возникающие между эритроцитами и клеточной стенкой, благодаря отрицательному заряду мембран эритроцитов и интимы сосудов, в числе прочих факторов имеют значение для агрегационной устойчивости эритроцитов в кровотоке, нельзя исключить значение данного стабилизирующего механизма для патологических состояний, сопровождающихся стазом, тромбозом и ишемией тканей.
Стоит отметить, что ранее, независимыми исследователями была выявлена определенная взаимосвязь частоты возникновения таких заболеваний, как ишемический инсульт и ишемическая болезнь сердца, а также различия в показателях свертываемости крови у больных облитерирующим атеросклерозом от группы крови [2, 7, 8, 11].
Обнаруженные закономерности в большей встречаемости определенной группы крови у пациентов с исследуемой патологией, не исключая иных причин, также могут быть объяснены различным исходным зарядом эритроцитов и, как следствие, неодинаковым риском тромбообразования в условиях патологически измененного кровотока и нарушения функции эндотелия сосудов.
Учитывая высокий уровень летальности и инвалидизации при развитии подобных заболеваний, выявление факторов риска, в том числе различной склонности к агрегации эритроцитов разных групп крови позволит более индивидуально подходить к вопросам лечения и профилактики у таких пациентов.
Литература
1. Минеева Н.В. Группы крови человека, основы иммуногематологии / С-Петербург, 2004г, с7-9, с18-21.
2. Мешалкин Е.Н. Группы крови систем АВО и RH у больных с сердечно-сосудистой патологией / Е.Н. Мешалкин, Г.Н. Окунева, Ю.А. Власов, Н.Н. Вельтмандер // Кардиология. – 1981, - №4 с.46-50.
3. Кабанов Д.С. Изменение поверхностных характеристик мембраны эритроцитов при встраивании липополисахаридов грамотрицательных бактерий / Д.С. Кабанов // Диссертация на соискание ученой степени кандидат биологических наук: 03.00.04 Пущино, 2006 84 с. РГБ ОД, 61:07-3/256.
4. Прокоп О. Группы крови человека / О. Прокоп, В. Гёлер, под.ред В.В. Томилина // М:.Медицина, 1991г, с23-28.
5. Способ регистрации поверхностного заряда эритроцитов: Патент РФ: G01N33/49 Шереметьев Ю.А.; Макин Г.И.; Суслов Ф.Ю.; заявитель и патентообладатель Нижегородский сельскохозяйственный институт; Научно-исследовательский институт химии при Нижегородском университете. – № 4947820/14; заявл. 24.06.91 ; опубл. 20.01.95.
6. Чижевский А.Л. Аэроионификация в народном хозяйстве / М.: Стройиздат 1989. – с.174-175.
7. Чубарь С.В. АВО группы крови, Rh-принадлежность и свертывание крови у больных облитерирующим атеросклерозом./ Врачеб. дело. – 1980. - №9, с83-86.
8. Чиныбаева А.А. Распределение эритроцитарных антигенов у больных с церебральным инсультом / А.А. Чиныбаева //Журнал Неврологии и Психиатрии, выпуск 13, 2005; с55-57.
9. Шереметьев Ю.А. Изучение механизма агрегации эритроцитов, индуцированной La3+ / Ю.А. Шереметьев, А.В. Шереметьева, Г.Я. Левин /I Всес. биофиз. сьезд. Тез.докл. М.: 1982. - Т. 2.- С. 115.
10. Шереметьев Ю.А. Морфо-физиологический анализ механизмов La3+-индуцируемых агрегации и слияния эритроцитов / Ю.А. Шереметьев // диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук, Н.Новгород, 2007, 151с.
11. Рафалович М.Б. Группы крови АВО как фактор риска ишемической болезни сердца и артериальной гипертонии у различных этнических популяций / М.Б. Рафалович, А.М. Мазурова, М.Н. Минаева, Г.А. Бессонова, Н.И. Зильберт, Г.Т. Тарала, Л.Г. Ледуховская // Врачеб. дело. – 1980. - №9, с.72-75.
12. Abramson H. A. The electrical charge of mammalian red blood cells / H. A. Abramson, A.D Laurence, S. Moyer // The Journal Of General Physiology March 20, 1936, p601-607.
13. Abramson H. A. The cataphoretic velocity of mammalian red blood cells // The Journal Of General Physiology, July 20, 1929, vol. 711-725.
14. Abramson H. A. The influence of size, shape and conductivity of microscopically visible particles on cataphoretic mobility // H. A. Abramson, L. Michaelis / The Journal Of General Physiology, March 20, 1929, vol. 587-598.
15. Cohen M. ABO blood group glycans modulate sialic acid recognition on erythrocytes / Cohen Miriam, Nancy Hurtado-Ziola and AjitVarki // Blood, 2009 114: 3668-3676.
16. Durocher J.R. Role of sialic acid in erythrocyte survival / J. R. Durocher, Robert C. Payne, and Marcel E. Conrad // Blood, 1975 45: 11-20.
17. Danon D. The sequestration of old red cells and extruded erythroid nuclei, in Ramot B(ed)/ D. Danon, Y. Marikovsky, E. Skutelsky // Red Cell Structure and Metabolism. New York, Academic, 1971, pp 23-38.
18. Eylar E.H. The contribution of sialic acid to the surface charge of the erythrocyte / E.H. Eylar, Morton A. Madoff, O.V. Brody, J.L. Oncley // The Journal Of Biological Chemistry, vol. 237, No. 6, June 1962.
19. Fozzard H.A. Effect of formaldehyde and glutaraldehyde on electrical properties of cardiac purkinje fibers / H. A. Fozzard, G. Dominguez // The Journal Of General Physiology, vol. 53, 1969, 530-540.
20. Kung-Ming Jan. Role of Surface Electric Charge in Red Blood Cell Interactions / Kung-Ming Jan, Shu Chien // The Journal Of General Physiology, vol. 6, 1973.
21. Lerche D. Investigation of the La3+ - induced aggregation of human red blood cells / D. Lerche, E. Hessel, E. Donath // Stud, biophys. - 1979. - Vol.75. - P.95-106.
22. Lerche D. Scanning electron microscopic characterization of the La3+ and concanavalin A- induced aggregation of untreated and neuraminidase- treated human erythrocytes / D. Lerche, K. Augsten, E. Donath // Exp. Path. - 1981. - Vol.20.-P.156-162.
23. Shiga T. Kinetic measurement of red cell deformability: a modified micropipette aspiration technique / T. Shiga, N . Maeda, T. Sudo // Jap. J. Physiol. -1979.-Vol.29.-P.707-722.
24. Shu Chien. N-Acetylneuraminic Acid Deficiency in Erythrocyte Membranes: Biophysical and Biochemical Correlates / Shu Chien, George W. Cooper, Jr., Kung-ming Jan, Louis H. Miller, Calderon Howe, Shunichi Usami, Parviz Lalezari // Blood, 1974 43: 445-460.
25. Stoltz J.F. Red blood cell agregation: measurment and clinical application / J.F. Stoltz, M. Donner // Jurk.j.of med. Sciences, 1991, v.15, №1.
26. Seaman G. V. F. Red cell agins. Surface charge density and sialic acid content of density-fractionated human erythrocytes / G. V. F. Seaman, R. J. Knox, F. J. Nordt, and D. H. Regan // Blood, 1977 50: 1001-1011.
27. Yaari A. Mobility of human red blood cells of different age groups in an electric field / // Blood, 1969 33:159-163.
Поступила в редакцию 26.09.2011 г.