Газохроматографическая оценка сывороточных холановых кислот с целью диагностики жировой болезни печени
Кадыров Абдурахмон Хафизович,
доктор химических наук, профессор,
Саидов Самир Сангинович,
кандидат химический наук, доцент,
Абдурахимова Мохруби Кодыровна,
соискатель.
Институт гастроэнтерологии АМН МЗ Республики Таджикистан.
Институт химии В. И. Никитина АН РТ.
Gas chromatographic evolution of serum bile acids for diagnosis fat liver disease
A.H.Kadirov., S.S.Saidov., M.K.Abdurahimova,
Institute of gastroenterology, Academy of Sciences of the Republic of
Tajikistan.
V.I. Nikitin Institute of chemistry, Akademy of Sciences of the Republic of
Tajikistan.
Использовано газохроматографическое результаты по определению содержания холановых кислот в сыворотке крови с целью диагностике и эффективного лечения жировой болезни печени.
Ключевые слова: желчные кислоты, определение, хроматографи, газововая.
Used gas chromatographic results сholanic acid content in the blood serum for diagnosis and effective treatment of fatty liver disease.
Keywords: Bail acids, analis, gas-liquid chromatography.
На современном этапе развития науки проблема диагностики и эффективного лечения желчнокаменной и других болезней печени, их многочисленных и тяжелых осложнений для жизни больных остаётся окончательно не решенной и продолжает привлекать внимание широкого круга химиков, биохимиков, клиницистов и научных исследователей.
Анализ литературы показывает, что имеются незначительные сведения о количественном составе холановых кислот в желчи и сыворотке крови больных на различных этапах литогенеза, а также при жировой болезни печени и соотношении важнейших из них при наличии желчных камней и содержании их в желчных камнях.
Существуют различные мнения о том, что решающее значение в этиологии желчнокаменной болезни имеет нарушение нормального метаболизма холестерола и его переход в холановые кислоты. С другой стороны, те же самые кислоты и их аналоги в ряде случаев могут служить эффективными средствами для лечения желчнокаменной болезни [1].
Все это показывает перспективность всесторонних исследований по выявлению существующей связи между химией холестерола, холановых и жирных кислот, а также других компонентов желчи и сыворотки, включая их трансформацию и методы определения.
Исходя из этого, разработка достоверных и доступных методов определения содержания холестерина, холановых и жирных кислот в желчи и сыворотки крови у здоровых людей и у больных с разными патологиями печени. Также распознавание изменения вышеуказанных компонентов под действием различных препаратов в организме представляет собой актуальную задачу как в аспекте развития химии и биохимических исследований, так и для практической медицины.
Результаты и их обсуждение
Разработка оптимального условия определения желчных кислот и использование этих результатов для диагностики жировой болезни печени в соответствии с настоящим исследованием является важным и ещё не описано в литературе.
Анализ литературных данных [2] показывает, что свободные жирные кислоты, в большом количестве высвобождающиеся из жировой ткани брюшной полости, поступают по воротной вене в печень, а затем в системный кровоток. Жирные кислоты, поступающие в системный кровоток, нарушают функцию инсулиновых рецепторов и усугубляют инсулин резистентности. Избыточное поступление жирных кислот в печень приводит к усилению синтеза в ней триглицеридов и липопротеидов очень низкой плотности, увеличивая их содержание в крови. Эти процессы способствуют развитию жировой болезни печени.
Для диагностики жировой болезни печени использовали различные биохимические методы исследования на примере определения общего билирубина и его фракций. Определение общего холестерола, общего белка, активности ферментов АсАТ, АлАТ, ЩФ, ГГТ уровня инсулина, ультразвуковое исследование и рентгенологические и др. результаты, которые не позволяют дать окончательную постановку диагноза при жировой болезни печени.
Например, степень повышения активности ферментов АсАТ и АлАТ не является достаточным показателем тяжести процесса и не имеет отчетливой корреляции с выраженности стеатоза и фиброза печени.
На данном этапе развития медицинской науки не существует какого-либо одного лабораторного метода исследования, по отдельности позволяющего достоверно подтвердить или исключить диагноз жировой болезни печени.
Известно также совсем другой подход в диагностике жировой болезни печени [3] который основывается на изучение эффективности инсулина на синтез липидов печени и даже непосредственно в сосудистой стенке. Метод определения инсулина дало возможность определять, что избыток инсулина не только усиливает синтез холестерола, жирных и холановых кислот, липопротеинов низкой и очень низкой плотности, но и существенно тормозит процессы липолиза.
Однако использование данных определения инсулина недостаточно, чтобы поставить точный диагноз жировой болезни печени. Использование этих методов и другого биохимического анализа сыворотки крови не даёт степень участие жирных и холановых кислот в развитии этого процесса.
Известен другой подход для установления диагноза жировой болезни печени [4]. Принцип данного подхода к постановке диагноза жировой болезни печени заключается в том, что увеличение суммы концентрации холановых кислот свидетельствует о заметной функции печени. По очищению портальной крови от циркулирующих холатов, или на фоне инсулин резистентности печени активно увеличиваются холановые кислоты.
Здесь не определено содержание каждой по отдельности желчных кислот в сыворотке крови у больных жировой болезнью печени, а также не учтено образование холиеновых кислот и избыточное содержание холестерола из которого синтезируется большое количество первичных желчных кислот, в печени. Но это все недостаточно для того чтобы поставить определенный диагноз жировой болезни печени.
Целью нашего исследований является нахождение дополнительного метода и подхода, который по сравнению с другими существующими, методами был бы более точным и информативным в определение содержания холановых кислот, (на примере холевой-, хенодезоксихолевой-, дезоксихолевой-, дегидрохолевой-, литохолевой кислоты) будучи в тоже время нетрудоемким и информативным [5].
Содержание сывороточных холановых кислот определяли газохроматографическим методом, для чего использовали газовый хроматограф «Хром-5» (Чехия), с пламенно-ионизационным детектором, а также при использовании режима программированных температур [6].
В качестве внутреннего стандарта использовали метиловый эфир 3α,7α-дигидрокси-12-кетохолановой кислоты.
Преобразование холестерола в желчных кислотах осуществляется в гепатоцитами и считается одной из важных и специфических функций печеночных клеток. Следовательно, уровень холановых кислот сыворотки при различных поражениях печени отражает степень нарушения их синтеза печенью, а данные об их количественном составе могут служить ценной информацией о функциональном состоянии гепатоцитов.
Предлагаемый новый подход с учетом точного содержания желчных кислот как дополнительного теста с целью постановки диагноза у больных жировой болезнью печени, является новым, менее трудоемким и требует сравнительно малых средств.
Преимущество данного подхода к диагностике жировой болезни печени заключается в том, что сдвиги в содержании холановых кислот в сыворотке крови у больных жировой болезнью печени наступают раньше, чем другие показатели изменения функционального потенциала печени, в связи с чем они являются более чувствительными к тестам.
Количество и соотношение отдельных холановых кислот отражает функциональное состояние гепатоцитов и зависит от степени заболеваемости при жировой болезни печени.
Холановые кислоты являются конечным продуктом метаболизма холестерола и одним из самых важных путей его выведения из организма. Почти до 80% общего количества холестерола окисляется в холановые кислоты. Биохимический синтез желчных кислот осуществляется в гладком эндоплазмическом ретикулуме гепатоцитах преимущественно из вновь синтезированного холестерола. В связи с этим количественное определение холановых кислот в сыворотке крови больных жировой болезнью печени приобретает важное значение в целях диагностики и оценки эффективности лечения
Дана оценка содержания холановых кислот в сыворотке крови у больных жировой болезни печени: установлено, что при жировой болезни печени в случае стеатоза содержание желчных кислот составляет: холевой 0,42±0.08мг/мл; хеноезоксихолевой – 0,092±0.01мг/мл; дегидрохолевой – 0,013±0.002мг/мл; дезоксихолевой – 0,037±0,007 мг/м и литохолевой – 0,16±0,003мг/мл. (см. таблицу 1).
Однако в случае стеатогепатита также было отмечено заметное повышение концентрации 3α,7α-дигидрокси-0,110±0,022мг/мл; 3α,7α,12α-тригидрокси-1,17мг/мл; 3α,12α-дигидрокси-0,041±0,003мг/м 3α,7α,12α-трикетохолановых кислот 0,15±0,004мг/мл. Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных со стеатозом и стеатогепатитом значительно возрастало суммарное содержание холановых кислот.
На основе полученных результатов построили график содержания холановых кислот в зависимости от стадии неалкогольной жировой болезни печени (рис. 1).
Рис. 1. Содержание холоновых кислот в зависимости от стадии неалкогольной жировой болезни печени.
Известно [7], что желчные кислоты соединяются с высшими жирными кислотами, образуя растворимый в воде комплекс (холиеновые кислоты), который поступают в стенку кишки и в эпителиальных клетках кишечных ворсинок вновь распадается на желчные и жирные кислоты.
Желчные и жирные кислоты входят в состав растворимых молекулярных комплексов в различных соотношениях, т. е. на каждую молекулу жирной кислоты приходится не менее 2 и не более 4 молекул желчных кислот.
Таблица 1.
Содержание холановых кислот в сыворотке крови здоровых людей и больных стеатозом печени и стеатогепатитом (М±m), мг/мл.
|
Холановые кислоты |
Практически эдоровые (n=24) |
Больные |
|
|
Стеатоз (n=63) |
Стеатогепатит (n=21) |
||
|
3α-гидрокси- |
0,0010±0,0002 |
0,160±0,003 |
0,038±0,008 |
|
3α,12α-дигидрокси- |
0,0033±0,0003 |
0,037±0.007 |
0,0041±0,003 |
|
3α,7α-дигидрокси- |
0,0066±0,0005 |
0,092±0,010 |
0,110±0,022 |
|
3α, 7α ,12α-трикето- |
|
0,013±0,002 |
0,015±0,004 |
|
3α, 7α ,12α-тригидрокси- |
0,0068±0,0005 |
0,420±0,080 |
1,170±0,090 |
|
∑ холановых кислот |
0,017±0,003 |
0,570±0,120 |
1,370±0,200 |
*n – количество здоровых и больных людей.
Таким образом, показано, что в сыворотке крови больных жировой болезнью печени по сравнению с контрольным значительно возрастало содержание холановых кислот и установлено, что это происходит за счет активации процесса гидролиза холиеновых кислот.
Экспериментальная часть
Условия хроматографирования. Колонку длиной 1,26 м с внутренним диаметром 0,3 см заполняли фазой: хроматон N-AW зернения 0,160-0,200 мм, нанесенный 3% SE-30. Температура термостата (хроматографической колонки), 250 0С, температура испарителя 290 0С, детектора 270 0С, скорость газ-носителя (азот) 40мл/мин, скорость водорода 30мл/мин, продолжительность анализа 30 мин. для идентификации пиков использовались хроматографически чистые эталоны метиловых эфиров желчных кислот. Все полученные хромотограммы оценивали методом внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта использовали 3α,7α- дигидрокси-12- кетохолевой кислоты
К сыворотке объёмом 1 мл добавляли 3 мг/мл раствора внутреннего стандарта, 3α,7α-дигидроокси-12-кетохолевой кислоты. Экстрагировали с 15 мл хлороформ-метанольной смеси (2:1) в течение 10 мин. После чего фильтровали и для расслоения фаз в смесь добавляли 3 мл бидистиллированной воды и центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 10 мин. Верхний водный слой, содержащий холановые кислоты, осторожно отсасывали при помощи водоструйного насоса и выпаривали досуха на песочной бане без доступа влаги. Затем к содержимому колбы добавляли 2 мл воды, 1 мл этиленгликоля, 1 мл 4 н. раствора NaOH и гидролизировали в течение 1,5 часа при 140-145 0С. После охлаждения и разбавления удаляли все липиды путем двукратного экстрагирования диэтиловым эфиром. Затем подкисляли водный слой 10% раствором соляной кислоты и двукратно экстрагировали холановые кислоты эфиром. Эфирные экстракты объединяли, промывали водой до нейтральной реакции и сушили над сульфатом натрия. После чего полностью отгоняли эфир и для преодоления сильной полярности холановых кислот их метилировали в среде 5 мл метилового спирта в присутствии следов концентрированной серной кислоты в течение 1,5 ч. После охлаждения колбы с полученными метиловыми эфирами холановых кислот экстрагировали дважды эфиром. Эфирный экстракт промывали и сушили над сульфатом натрия. После отгонки растворителя метиловые эфиры холановых кислот переносили во флакон путем растворения в 0,3 мл этанола с целью введения в хроматограф.
Литература
1. Максимов В.А., Чернишев А.Л., Тарасов К.М., Неронов В.А. Билиарная недостаточность. М. ООО Изд. Товарищество «Адамант», 2008. – с. 21-28.
2. Lonardo A., Lambardini S., Scaglioni F., Caruli L., Ricchi M., Ganazzi D., Adinolfi L.E., Ruggiero G., Coruli N., Loria P. Hepatic steaosis and insulin resistencl: does etiology make a differences? //J.Hepatol.- 2006, jan.-№44 (1). – р. 190-196.
3. Grempler R., Gunter S., Steffensen K.R., Nilsson M., Barthel A., Schmoll D., Walther R. Evidence for an indirect transcriptional regulation of glucose-6-phosphatase gene expression by liver x receptors. //Am. J. Gastroenterol.- 2006 Jan.-Vol. 101 (1). – P, 70-75.
4. Вахрушева Я.М., Счкова Е.В. Жировой гепатоз // Тер. Арх., т. 78, №11,-с. 83-86.
5. А.Х. Кадыров, Г.К. Мироджов, М.Н. Худжамуродов, Н.К. Самандаров, А.А. Кодиров, М.К. Абдурахимова, М.П. Султонмамадова. Применение новый способ к диагностике жировой болезни печени // Патент РТ № TJ 524. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Республики Таджикистан от 4.09.2011 г.
6. Кадыров А.Х., Мансурова Ф.Х., Худжамуродов М.Н. Содержание желчных кислот сыворотки крови здоровых и больных метаболически синдромом с проявлением желчнокаменной болезни. Российские журнал Гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение №32. Москва. 2008, т. XVIII, №5. – с.117.
7. А.Х. Кадыров, Г.О. Раджабов, А.А. Кодиров, М.Н. Худжамуродов, Г.Х. Давлатова. Исследование содержания желчных кислот в сыворотке крови здоровых лиц и больних со стеатозом печени и стеатогепатитом // В кн. Вопросы питания и регуляция гомеостаза, Выпуск 10. Душанбе -2010. –с. 138-143.
Поступила в редакцию 14.11.2012 г.