Иммунологические маркеры течения беременности после IVF методом ИКСИ, обоснование иммуномодулирующей терапии

Туманова Лариса Евгеньевна,

доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний в акушерстве,

Чернышов Виктор Павлович,

доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории иммунологии,

 Коломиец Елена Владимировна,

старший научный сотрудник отделения профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний в акушерстве,

Молчанова Елена Александровна,

аспирантка.

ГУ «Институт педиатрии, акушерства и гинекологии Национальной академии медицинских наук Украины», г. Киев.

В статье проведен анализ показателей системы натуральных киллеров (НК) у женщин, которым было проведено экстракорпоральное оплодотворение (IVF) методом интрацитоплазматического введения сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ). Критерием включения пациенток в основные (I и II) группы была беременность после IVF методом ИКСИ: І группу составили беременные с наличием только мужского фактора бесплодия, II группу – беременные с сочетанным: мужским и женским (трубно-перитонеальным) бесплодием. У беременных после IVF (ИКСИ) с мужским и сочетанным бесплодием характерно нарушение функции НК клеток в виде снижения KIR рецептора на НК клетках и повышение их цитотоксической активности.

На фоне снижения экспрессии KIR рецептора (англ. Killer inhibitory receptor) цитотоксичность НК клеток выходит из-под контроля и повышается. Эти же закономерности выявлялись и при осложнениях в динамике беременности. Именно это и стало обоснованием для внутривенного применения нормального иммуноглобулина беременным после IVF с мужским и с мужским и трубно-перитонеальным факторами бесплодия. Известно, что внутривенный иммуноглобулин угнетает активность натуральных киллеров, поэтому он может применяться при угрожающих выкидышах.

Ключевые слова: беременность, IVF, ИКСИ, натуральные киллеры, нормальный иммуноглобулин.

Беременность после IVF сопровождается большим количеством гестационных осложнений. Часто у этих женщин имеет место угроза прерывания беременности, особенно, в ранних сроках. Общеизвестно, что изменение взаимоотношений иммунологических факторов способствуют развитию ранних потерь беременности.

НК клетки (натуральные киллеры) играют важную роль в сохранении беременности. Они регулируют и контролируют имплантацию трофобласта, способствуют его росту и дифференцировке, поддерживают ремоделинг спиральных артерий, обеспечивают иммуномодулирующую роль [1; 3; 4]. Так, как НК клетки играют значительную роль в зачатии и пролонгировании беременности, любые изменения в их активности могут приводить к осложнениям беременности и выкидышам [2; 5]. Показано, что у женщин с повторными выкидышами имеются повышенные цитотоксическая активность и количество НК клеток периферической крови [6; 7; 8]. У бесплодных женщин наблюдается дисбаланс в экспрессии поверхностный маркеров НК клеток и продукции цитокинов [9; 10]. НК клетки несут рецепторы подавления цитотоксичности (KIR, англ. Killer inhibitory receptor). При отрицательном распознавании они взаимодействуют с молекулами MHC класса I на клетке-мишени и эти рецепторы дают НК клетке сигнал тормозить ее цитотоксическую активность. Среди KIR рецепторов наиболее подходящим является CD158a, в связи с тем, что его экспрессия не ассоциируется с индивидуальным HLA типом [10].

Цель исследования – изучить различия в показателях системы естественных киллеров у беременных двух групп, которым проведено IVF методом ИКСИ; определить взаимосвязь этих изменений с возможными осложнениями гестации.

Материалы и методы исследования

Для изучения показателей системы естественных киллеров обследовано 111 беременных. Критерием включения пациенток в основные (I и II) группы, была беременность после IVF методом ИКСИ. І группу составили 40 беременных с наличием только мужского фактора бесплодия, II группу – 40 беременных с сочетанием мужского и женского (трубно-перитонеального) факторов бесплодия. Контрольную группу составила 31 беременная без соматической и гинекологической патологии.

При иммунологическом анализе крови женщин с мужским и сочетанным бесплодием различия регистрировали в показателях системы естественных киллеров. Применялись следующие методы определения цитотоксичности НК: выделение мононуклеаров периферической крови и НК тест.

Выделение мононуклеаров периферической крови (МПК). 4 мл гепаринизированной крови разводили 8 мл DPBS и разделяли градиент плотности Histopaque ™ – 1077 («Sigma», США) 30 мин. при 400 g. МПК трижды отмывали DPBS, подсчитывали в камере Горяева и доводили до концентрации 3 * 10⁶ / мл в среде RPMI, которая вмещала 20% бычьей сыворотки.

НК тест. Мононуклеары крови инкубировали с меченой К562 в соотношениях 20/1, 10/1 и инкубировали 4:00 в СО₂ инкубаторе («Revco» Швейцария). После инкубации добавляли 10 мкл (5 мг/мл) раствора пропидий йодид (РИ) и инкубировали 20 мин при t + 4C. Анализировали на приборе FACSCan (Becton Dickinson), (мишени, меченые CFDА, имели зеленую флюоресценцию, а пермобилизованные мертвые клетки (РИ⁺) – красную флюоресценцию).

Результат выражали как относительное содержание лимфоцитов соответствующей субпопуляции (%) и абсолютный уровень этой же субпопуляции лимфоцитов, соотношение содержания клеток (безразмерный показатель). Клеточные соотношение рассчитывали как отношение количества CD3 + 4 + до такой CD3 + 8 + клеток (CD3 + 4 + / CD3 + 8 +). Естественные киллеры определяли как CD3-56 +. Определение экспрессии HLA-DR и CD69 на СD3 +, CD4 +, CD8 + лимфоцитах и натуральных киллеров (СD3-CD56 +) проводили аналогичным образом на нативных клетках цельной крови. Результат выражали как процент HLA-DR и CD69 положительных среди клеток соответствующего фенотипа (% HLA-DR и CD69 на CD3 +,% HLA-DR и CD69 на CD4 +,% HLA-DR и CD69 на CD8 +,% HLA-DR на CD3-CD56 +).

В иммунологии есть понятие, как ADCC – антителозависимая клеточная цитотоксичность – для уничтожения клеток мишеней. При ADCC необходимо одновременное участие антител и эффекторных клеток. Антитела обволакивают клетку-мишень, обеспечивая специфичность реакции, а эффеторные клетки, связывая концы Fc-фрагментов этих антител, создают цитотоксический эффект [9; 10].

Обозначается это как – Э : М – соотношение эффектор : мишень; Эф/мишень

Результаты иммунологического анализа приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Показатели системы НК клеток у пациенток с мужским и сочетанным бесплодием (x±SD).

Анализ полученных нами иммунологических данных показал, что уровень натуральных киллеров (CD56 + CD3-) у беременных пациенток с мужским (І гр.) и отдельно с мужским и трубно-перитонеальным факторами (II гр.), которые осложняли беременность, существенно не отличался. Но уровень экспрессии KIR рецептора на натуральных киллерах (СD158 + СD56 + CD3-) был существенно ниже по сравнению с показателями женщин со спонтанной беременностью (КГ). При изучении цитотоксичности натуральных киллеров были отмечены повышенные показатели цитотоксичности НК клеток у пациенток с беременностью после IVF, при этом при осложнении беременности мужским и трубно-перитонеальным факторами цитотоксичность НК клеток была еще выше в сопоставлении с пациентками, у которых был только мужской фактор (таблица 1).

Иммунологические показатели, основанные на ретроспективном анализе осложнений, которые были во время беременности, приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Показатели системы НК клеток при осложнённой беременности: спонтанной беременности и у пациенток с мужским и сочетанным бесплодием.

Как видно из таблицы 2 содержание НК клеток не отличался в зависимости от группы пациенток, то есть эти осложнения были и в группе спонтанной беременности и в группах после IVF: с мужским фактором и с сочетанным мужским и трубно-перитонеальным факторами. Экспрессия KIR рецептора существенно была пониженной в группе осложненной беременности с мужским фактором и еще в большей степени в группе осложненной беременности с мужским и трубно-перитонеальным факторами. Противоположная закономерность была обнаружена при изучении цитотоксичности натуральных киллеров. Она существенно была повышенной в группе осложненной беременности с мужским и трубно-перитонеальным факторами. Эти данные подтверждены с помощью трех различных тестов (таблица 2).

Результаты иммунологических исследований подтвердили, что у беременных после IVF (ИКСИ) с мужским и с мужским и трубно-перитонеальным факторами бесплодия характерно нарушение функции НК клеток в виде снижения KIR рецептора на НК клетках и повышение цитотоксичности натуральных киллеров в сравнении с показателями пациенток со спонтанной беременностью. При этом группа пациенток с сочетанным мужским и трубно-перитонеальным факторами бесплодия имела более высокие показатели цитотоксичности НК клеток. В противоположность этой тенденции экспрессия KIR рецептора (CD158a), который должен угнетать активность НК клеток при осложнениях, понижается. Именно, при сочетанном бесплодии, то есть при беременности после IVF (ИКСИ) с мужским и трубно-перитонеальным факторами, это снижение было более существенным.

 Итак, на фоне снижения экспрессии KIR рецептора цитотоксичность НК клеток выходит из-под контроля и повышается. Эти же закономерности выявлялись и при осложнениях в динамике беременности. Именно это и стало обоснованием для внутривенного применения нормального иммуноглобулина беременным после IVF с мужским и с мужским и трубно-перитонеальным факторами бесплодия. Известно, что внутривенный иммуноглобулин угнетает активность натуральных киллеров, поэтому он может применяться при угрожающих выкидышах.

Была поставлена задача создания способа профилактики невынашивания беременности у женщин после IVF методом ИКСИ с наличием мужского и мужского и трубно-перитонеального факторов бесплодия.

Нами предложена новая методика профилактики и лечения осложнений, связанных с прерыванием беременности, у женщин этой группы. Он заключается в том, что женщине при проведении IVF методом ИКСИ при сочетании мужского и трубно-перитонеального факторов бесплодия, назначают микронизированный прогестерон по 400 мг/в сутки интравагинально, за 2 недели до имплантации и до 16 недель беременности; иммуноглобулин Биовен по 200 мл в/в, 1 раз в 4 недели до зачатия 1-3 раза и после зачатия до 12 недель беременности.

 Анализ полученных клинических, функциональных и лабораторных результатов исследования подтвердили эффективность этой методики, что дает нам право рекомендовать её для широкого использования в практическом здравоохранении.

Выводы

Для осложнённой беременности после IVF (ИКСИ) с мужским и сочетанным факторами бесплодия характерно нарушение функции НК клеток в виде: снижения KIR рецептора на НК клетках и повышения их цитотоксичности, что является основанием для назначения терапии Биовеном – нормальным иммуноглобулином. Биовен угнетает активность натуральных киллеров и поэтому может применяться при угрожающих выкидышах.

Литература

1.                  Michael A. Caligiuri. Human natural killer cells / A. Michael // Blood. – 2008. – 112, №3. – P. 461-469.

2.                  Raymond W. Redline. Role of uterine natural killer cells and interferon γ in placental development / W. Raymond //J. Exp. Med. – 2000. – 17, №2. – P. 1-4.

3.                  Expression of angiogenic growth factors by uterine natural killer cells during early pregnancy / Gendie E. Lash, Barbara Schiessi, Maureen Kirkley et al. // J. of leukocyte biology. – 2006. – 80. – P. 572-580.

4.                   Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56 (bright) subset / Cooper M. A., Fehniger T. A., Turner S. C. et al // Blood 2001. – 97. – P. 3146-3151.

5.                   Coulam C.B. Correlation of NK cell activation and inhibition markers with NK cytotoxicity among women experiencing immunologic implantation failure after in vitro fertilization and embrio transfer. / C.B. Coulam, R.G. Roussev // J. Assist Reprod Genet. – 2003. – 20. – P. 58-62.

6.                  Increased natural killer-cell activity is associated with infertile women / Matsubayashi H, Hosaka T, Sugiyama Y, Suzuki T, Arai T, Kondo A, Sugi T, Izumi S, Makino T // Am. J. Reprod. Immunol. – 2001. – 46. – P. 318-322.

7.                  Aberrant cytokine production by peripheral blood mononuclear cells in recurrent pregnancy loss? / M.D. Bates, S. Quenby, K. Takakuwa et al. // Human reproduction. – 2002. – 17, №9. – P. 2439-2444.

8.                  Assisted reproductive techniques in patients with Klinefelter syndrome: a critical review/ Denschlag D. et al. // Fertil Steril. – 2004. – № 82(4). – P. 775-779.

9.                  Cline A., Kutteh W. Is there a role of autoimmunity in implantation failure after in-vitro fertilization? // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. – 2009. – V.21, №3. – P. 291-295.

10.              Множественные иммунные акцентуации при неудачах имплантации в циклах экстракорпорального оплодотворения и эффективность применения внутривенного иммуноглобулина / Чернышов В.П., Судома И.А., Донской Б.В., Гончарова Я.А. // Журнал НАМН Украины. – 2013. – 19. – С. 212-218.

Поступила в редакцию 11.02.2015 г.